脈沖場凝膠電泳
當雙鏈DNA分子超過一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑,，在瓊脂糖中的電泳速度會達到極限,，此時凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場電泳就解決了這一難題
脈沖電泳是在兩個不同方向的電場，周期性交替進行的,，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大,，這種構(gòu)象改變需要的時間越長,，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少,，因而在凝膠中移動越慢,。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子
脈沖場凝膠電泳
1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)
2 配套試劑：脈沖電泳專用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE
3 染料：GelRed等
在凝膠電泳中,，溫度越高,，DNA移動的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會明顯下降,。溫度過高會導致DNA帶變形或解鏈,，一般設(shè)置電泳溫度為14℃
常用緩沖液是0.5×TBE H9812，2.2s-63.8s,，19h
脈沖場電泳常見問題及解決辦法
1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動泵的速度太快或太慢,， 調(diào)到合適的速度
2）緩沖液不流動或流速慢–檢查冷卻泵：當冷卻泵制 冷時，如果蠕動泵沒有開,，會造成管道內(nèi)結(jié)冰,，導 致管道堵塞
3）電泳條帶扭曲–流速太低，導致制冷不充分,，或不 均一,、緩沖液的體積不能太小
4）條帶變粗–減少上樣量
5）條帶拖尾或模糊–電場轉(zhuǎn)換時間不合適，優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場轉(zhuǎn)換時間,、上樣量太高,，調(diào)整樣品濃度
6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長電場轉(zhuǎn)換 時間
7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降,，更換緩沖液,、上 樣時樣品塊被擠碎,、泵速度太慢
聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）,。
聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：
1 在一定濃度時，凝膠透明,，有彈性,，機械性能好。
2 化學性能穩(wěn)定,，與被分離物不發(fā)生化學反應(yīng),。
3 對pH和溫度變化較穩(wěn)定。
4 幾乎無電滲作用,，只要Acr純度高,，操作條件一致，則樣 品分離重復性好,。
5 樣品不易擴散,，且用量少。
6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié),。
7 分辨率高,，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮,、分子篩和 電荷效應(yīng)為一體,，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率,。
聚丙烯酰胺凝膠聚合
聚合原理
1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的,。 催化系統(tǒng)常用有兩種： 過硫酸氨—TEMED化學催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑,，它能以自由基的形式存在,。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS,，引發(fā)劑）形成自由基,。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng)，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠,。
2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中,，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基,，引發(fā)聚合反應(yīng),。TEMED的存在，可以加速聚合,，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置,。
凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)
1）聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T）,，以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔,、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的,，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。
2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān),，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切,。一般講，T濃度大,，孔徑小,，移動顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外,，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān),，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小,。
3）凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同,，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同,。在操作時，可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍,。也可先選用7.5%凝膠(標準膠),，因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試,，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果,。
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本文關(guān)鍵詞：脈沖場凝膠電泳,DNA電泳
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