1 儀器：垂直系列電泳槽；低,、中,、高壓電源；恒溫循環(huán)器
2 試劑： 丙烯酰胺,、甲叉雙丙烯酰胺,、過硫酸銨、TEMED,、 考馬斯亮藍(lán)\硝酸銀,、凝膠緩沖液、非變性上樣緩 沖液,、Tris堿,、甘氨酸等
聚丙烯酰胺凝膠電泳
變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 儀器：垂直系列電泳槽；低,、中壓電源,、恒溫循環(huán)器 2 試劑： 丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺,， SDS（ 十二烷基硫 酸鈉）溶液,、1.5MTris-HCl(pH8.8）、0.5MTris- HCl(pH6.8）,、TEMED,、10%(w/v)過硫酸胺溶液、SDS- Page上樣緩沖液:（ 0.5M Tris（ pH6.8）緩沖液,、甘油,、 10%SDS 、二硫蘇糖醇,、溴酚藍(lán)）,、Tris、甘氨酸,、SDS ,、考馬斯亮藍(lán) \硝酸銀等
SDS-Page，在蛋白質(zhì)裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT
巰基乙醇或DTT可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原,，使多肽分成單個亞單位,。
SDS-PAGE時,，在蛋白質(zhì)裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT
PAGE據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)
連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同,，帶電顆粒在電場作用下,，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分,、pH,、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性,，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng),、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng),，故分離效果更好,。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性,、緩沖液離子的不連續(xù)性,、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶,，然后進(jìn)行分離,。
樣品濃縮效應(yīng)
1） 凝膠孔徑的不連續(xù)性： 濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠,。在電場作用下,，樣品顆粒在 大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快,；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時,，受到的阻 力大，移動速度減慢,。因而在兩層凝膠交界處,，樣品遷移受阻而壓 縮成很窄的區(qū)帶。
2） 電位梯度的不連續(xù)性： 電泳開始后,，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強(qiáng)度很低 的低電導(dǎo)區(qū),，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶
緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性
Tris:緩沖配對離子,，維持溶液的電中性及pH值 Cl-: 在電場中遷移率快,，前導(dǎo)離子(leading ion)，快離子,。 Gly:其pI =6.0,，在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中，甘氨酸解離度很小,，因而在 電場中遷移很慢,，稱為尾隨離子（trailing ion）,，慢離子。當(dāng)進(jìn)入 pH8.8的分離膠時,，甘氨酸解離度增加,，其有效遷移率超過蛋白質(zhì);因此 Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。高電勢梯度不存在了,，各種蛋 白質(zhì)僅會由于其分子量或構(gòu)型的不同,，在一個均一的電勢梯度和pH條件 下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同 被分開 大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時均帶負(fù)電荷,，在電場中,，都向正極移動。
分子篩效應(yīng)
大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時,，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ,，這就是分子篩效應(yīng)。
電荷效應(yīng)
蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū),，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同,，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動率快慢順序排列成一個一個區(qū)帶,。在進(jìn)入分離膠時,，電荷效應(yīng)仍起作用。 目前,，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣,，雖然電泳過程中無濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離,，加之在溫和的pH條件下,，不致使蛋白質(zhì)、酶,、核酸等活性物質(zhì)變性失活,，也顯示了它的優(yōu)越性。
PAGE電泳據(jù)電泳裝置不同分為圓盤及垂直的板狀兩種
前者凝膠是在玻璃管中聚合,，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤狀,，因而稱為圓盤電泳； 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合,，故稱為垂直板狀電泳,。兩者電泳原理完全相同。
蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE時,，常用垂直板電泳,。
垂直板電泳的優(yōu)越性有：
表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng),，條帶更清晰,。
在同一塊膠板上可同時進(jìn)行10個以上樣品的電泳,，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影,。
膠板制作方便,，易剝離，樣品用量少,，分辨率高,，不僅可用于分析，還可用于制備,。
膠板薄而透明,，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描,。
可進(jìn)行雙向電泳,。
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